A CRISPR - CAS rendszer forradalmasította a génszerkesztés területét, egyszerűsége, nagy specifitása és hatékonysága miatt. Ugyanakkor, mint minden technológia, nem korlátozások nélkül. A CRISPR - CAS alkalmazásának egyik kihívása a nagy hatékonyságú génszerkesztés elérése, különösen a komplex genomokban és bizonyos sejttípusokban. A rekombinázok, a genetikai rekombinációt katalizáló enzimek nagy ígéretet tesznek a CRISPR - CAS rendszerek hatékonyságának javításában. Rekombináz beszállítójaként izgatottan vizsgálom meg, hogyan lehet ezeket az erőteljes enzimeket integrálni a CRISPR -hez, hogy felszabadítsák a génszerkesztés új lehetőségeit.
A CRISPR - CAS rendszer megértése
A CRISPR - CAS rendszer természetes védelmi mechanizmus a baktériumokban és az Archaea -ban az inváziós vírusok és plazmidok ellen. Egy vezető RNS -ből (GRNA) áll, amely egy specifikus DNS -szekvenciát és egy Cas nukleázot céloz meg, amely a DNS -t a megcélzott helyen hasítja. Miután a DNS hasították, a cella természetes javítási mechanizmusai játszanak. Két fő javítási út létezik: nem - homológ vége - csatlakozás (NHEJ) és homológia - irányított javítás (HDR). Az NHEJ hiba - hajlamos, és gyakran kis beillesztésekhez vagy deléciókhoz (indelek) vezet, míg a HDR felhasználható a pontos genetikai változások bevezetésére, amikor donor DNS -sablon van.
A CRISPR - CAS -közvetített génszerkesztés hatékonysága számos tényezőtől függ, ideértve a Cas nukleáz és a GRNS bejutását a célsejtekbe, a Cas nukleáz aktivitását a célhelyen, valamint a DNS -javítási útvonalak hatékonyságát. Sok esetben a HDR alacsony hatékonysága jelentős szűk keresztmetszet, különösen az elsődleges sejtekben és az in vivo alkalmazásokban.
Hogyan javíthatja a rekombinázok a CRISPR - CAS hatékonyságát
1. A homológia megkönnyítése - irányított javítás (HDR)
A rekombinázok döntő szerepet játszhatnak a HDR előmozdításában. A HDR egyik legfontosabb lépése a donor DNS -sablon inváziója a megcélozott DNS -be a célhelyen. A rekombinázok, például a baktériumokban a RecA, nukleoproteinszálak képezhetnek a donor DNS -en. Ez az izzószál ezután homológ szekvenciákat kereshet a hasított DNS -ben, és elősegítheti a szál invázióját, ami kritikus lépés a HDR -ben.
Például a CO -val - egy rekombináz átadása a CRISPR -CAS rendszerrel és a donor DNS -sablonnal, növelhetjük a sikeres HDR -események valószínűségét. Kimutatták, hogy ez a megközelítés jelentősen javítja a pontos génszerkesztés hatékonyságát a különféle sejttípusokban. A rekombináz segít leküzdeni a HDR -hez kapcsolódó kinetikus akadályokat, és ezáltal valószínűbb, hogy a cella a donor DNS -sablont javítás céljából használja, ahelyett, hogy a hibát igényli - az NHEJ Pathway -t.
2. A célzási specifitás javítása
A HDR előmozdítása mellett a rekombinázok javíthatják a CRISPR - CAS rendszer célzási specifitását is. Egyes rekombinázok képesek felismerni és kötődni a nagy affinitású specifikus DNS -szekvenciákhoz. A rekombináz kidolgozásával a CRISPR -CAS komplexummal való kölcsönhatáshoz növelhetjük a CAS nukleáz specifitását a célhelyre.
Ez úgy érhető el, hogy a rekombinázt a Cas nukleázhoz vagy egy rekombináz alapú célzási rendszer alkalmazásával a CRISPR - CAS kombinációjában összeolvasztják. A rekombináz elősegítheti a CAS nukleázának a megfelelő célhelyhez való vezetését, csökkentve a célhatásokat. KI - A célhatások komoly aggodalomra adnak okot a CRISPR - CAS alkalmazásokban, mivel nem szándékos genetikai változásokhoz és potenciális biztonsági kérdésekhez vezethetnek. A célzás specifitásának javításával a rekombinázok a CRISPR - CAS rendszer megbízhatóbbá és biztonságosabbá teheti a génterápiában és más alkalmazásokban való felhasználást.
3. A kromatin akadályok leküzdése
A kromatin szerkezete jelentős akadályt jelenthet a CRISPR - CAS rendszer hozzáféréséhez a cél DNS -hez. Az eukarióta sejtekben lévő DNS -t szigorúan hisztonfehérjékkel csomagolják, hogy kromatint képezzenek, ami korlátozhatja a Cas nukleáz és a GRNS kötődését a célhelyhez. A rekombinázok segíthetnek ezen kromatin -akadályok leküzdésében.
Egyes rekombinázok képesek kölcsönhatásba lépni a kromatin -kapcsolódó fehérjékkel és módosítani a kromatin szerkezetét a célhely közelében. Ez a cél DNS -t jobban hozzáférhetővé teheti a CRISPR -CAS rendszerhez, növelve a génszerkesztés hatékonyságát. Például egy olyan rekombináz alkalmazásával, amely képes átalakítani a kromatint, javíthatjuk a Cas nukleáz és a GRNS kötődését a célhelyhez, ami hatékonyabb DNS -hasítást és későbbi javítást eredményez.
Rekombináztermékeink és azok potenciálja a CRISPR - CAS javításában
Rekombináz -beszállítóként számos, magas színvonalú rekombinázterméket kínálunk, amelyek alkalmasak a CRISPR - CAS rendszerek hatékonyságának javítására. Rekombinázainkat gondosan tisztítottuk és jellemzik, hogy biztosítsák az optimális teljesítményt a génszerkesztési alkalmazásokban.
A rekombináztermékeinken kívül más enzimeket is kínálunk, amelyeket CRISPR - CAS -val és rekombinázokkal kombinálva lehet felhasználni a génszerkesztés hatékonyságának további javítása érdekében. Például,Exonukleáz III 2.0Használható a donor DNS sablon végének feldolgozására, így a HDR -hez is alkalmas.M - MLV H - 2.0Használható reverz transzkripcióhoz, amely hasznos lehet egyes génszerkesztési stratégiákban. ÉsDNS polimeráz 2.0Használható a donor DNS sablon szintetizálására vagy a javítási folyamat során a hiányosságok kitöltésére.
Esettanulmányok és alkalmazások
Számos sikeres esettanulmány készült, amely bebizonyította a rekombinázok alkalmazását a CRISPR - CAS hatékonyságának fokozására. Az egyik tanulmányban a kutatók rekombináz - segített CRISPR - CAS rendszert használtak a genetikai mutáció kijavítására az emberi indukált pluripotens őssejtekben (IPSC). CO -val - a rekombináz eljuttatása a CRISPR -CAS komponensekkel és a donor DNS -sablonnal, képesek voltak elérni a HDR szignifikánsan nagyobb hatékonyságát, összehasonlítva a CRISPR - CAS rendszer használatával. Ennek a megközelítésnek a génterápiában potenciális alkalmazása van a genetikai betegségek esetében, mivel lehetővé teszi a betegség pontos korrekcióját - a mutációkat okozó mutációkat.
Egy másik esetben rekombinázokat használtunk a CRISPR - CAS rendszer célzási specifitásának javítására a növényekben. A rekombináz alapú célzási rendszer kidolgozásával a kutatók képesek voltak csökkenteni a célhatásokat és növelni a génszerkesztés hatékonyságát a növényi növényekben. Ennek kihatása van a mezőgazdasági biotechnológiára, mivel felhasználható a jobb tulajdonságokkal rendelkező növények, például a betegség -rezisztencia és a megnövekedett hozam kialakulására.
Következtetés és cselekvésre ösztönzés
A rekombinázok nagy potenciállal bírnak a CRISPR - CAS rendszerek hatékonyságának javításában. A HDR előmozdításával, a célzás specifitásának javításával és a kromatin -akadályok leküzdésével a rekombinázok kezelhetik a CRISPR - CAS technológia néhány legfontosabb korlátozását. Rekombináz -beszállítóként elkötelezettek vagyunk a magas színvonalú termékek és technikai támogatás nyújtása mellett a Génszerkesztés területén dolgozó kutatók és biotechnológiai vállalatok számára.
Ha érdekli a rekombinázok használatának feltárása a CRISPR - CAS alkalmazások javítása érdekében, felkérjük Önt, hogy vegye fel velünk a kapcsolatot további információkért. Szakértői csoportunk segíthet kiválasztani a megfelelő rekombináztermékeket, és útmutatást nyújthat a kísérleti tervezéshez. Bízunk benne, hogy együtt dolgozhatunk veled a génszerkesztés mezőjének előmozdításában, és új megoldásokat hozhatunk az asztalhoz.
Referenciák
- Jinek, M., Chylinski, K., Fonfara, I., Hauer, M., Doudna, JA és Charpentier, E. (2012). Programozható kettős - RNS -vezetett DNS endonukleáz az adaptív baktériumok immunitásában. Science, 337 (6096), 816 - 821.
- Mali, P., Yang, L., Esvelt, KM, Aach, J., Guell, M., Dicarlo, JE, ... és Church, GM (2013). RNS - Vezetett emberi genommérnöki tervezés a Cas9 Science -en keresztül, 339 (6121), 823 -
- Li, X., Yang, Y., és Zhang, Y. (2016). Rekombináció: homológ rekombináció -alapú géntechnikai módszer. Nature Protocols, 11 (3), 476 - 492.
- Pinder, JC és Cheng, AW (2019). A CRISPR - Cas9 génszerkesztés fejlesztése DNS -vel - célzó rekombinázok. Módszerek a Molecular Biology -ban, 1970, 273 - 285.