A DNS -polimeráz kritikus enzim a molekuláris biológiában, amely központi szerepet játszik a DNS replikációs és javítási folyamatokban. A laboratóriumban a DNS -polimeráz tisztítása egy aprólékos és többlépcsős folyamat, amely gondos tervezést és végrehajtást igényel. Mint DNS -polimeráz beszállító, jól ismerem a tisztítási folyamat bonyolultságát, és szeretném megosztani veled a részleteket.
Kezdeti lépések: A sejtek növekedése és lízise
A DNS -polimeráz tisztításának első lépése gyakran az enzimet expresszáló sejtekkel kezdődik. Általában olyan baktériumokat használnak, mint például az Escherichia coli gazdasejtekként, mert könnyen tenyészthetők, gyorsan növekedhetnek, és genetikailag megtervezhetők a cél DNS polimeráz túlexpresszálására. A baktériumokat általában megfelelő tápközegben termesztik, szabályozott hőmérsékleti, pH és levegőztetési körülmények között. Például az E. coli -t gyakran 37 ° C -on tenyésztik olyan gazdag közegben, mint a Luria - Bertani (LB).
Miután a sejtek elérték a megfelelő sűrűségt, centrifugálással betakarítják őket. A sejtpelletet ezután pufferoldatban szuszpendáljuk. A DNS -polimeráz felszabadításához a sejtekből lízis lépést hajtunk végre. Számos módszer létezik a sejtlízisre, ideértve a mechanikai módszereket (például a szonikálást), a kémiai módszereket (mosószereket, például a Triton X - 100 -at) és az enzimatikus módszereket (lysozyme -t használva a baktériumsejt falának lebontására). A szonikálás népszerű választás, mivel hatékonyan megzavarhatja a sejteket anélkül, hogy az enzim jelentős károkat okozna. Ezt azonban gondosan kell ellenőrizni, hogy elkerüljék a mintát, amely a DNS polimerázt denaturálhatja.
Nyers kivonat előkészítése és pontosítása
A sejtlízis után a kapott keverék különféle sejtkomponenseket tartalmaz, beleértve a fehérjéket, nukleinsavakat, lipideket és sejtek törmelékét. Ezt nyers kivonatnak nevezik. A nagy méretű hulladék eltávolításához a nyers kivonatot nagy sebességgel centrifugálják. A felülúszót, amely oldható fehérjéket tartalmaz, beleértve a DNS -polimerázt, gondosan összegyűjtik.
Időnként a nyers kivonat továbbra is jelentős mennyiségű nukleinsavat tartalmazhat, amelyek zavarhatják a későbbi tisztítási lépéseket. Ezen nukleinsavak eltávolításához csapadék lépést lehet végrehajtani egy polikációs vegyület, például polietileneimin (PEI) alkalmazásával. A PEI kötődik a negatív töltésű nukleinsavakhoz, ami kicsapódást okoz, amelyet ezután centrifugálással lehet eltávolítani.
Kromatográfiás tisztítás
A kromatográfia a DNS polimeráz tisztításának sarokköve. Számos típusú kromatográfiás technikát lehet használni, amelyek mindegyike az elválasztás különböző alapelvein alapul.
Ion - cserélési kromatográfia
Az ioncsere -kromatográfia gyakran az első kromatográfiás lépés a tisztítási folyamatban. A nettó töltésük alapján elválasztja a fehérjéket. A DNS -polimerázok jellegzetes töltéssel rendelkeznek egy adott pH -nál, amely lehetővé teszi számukra, hogy kötődjenek egy pozitív töltésű (anion -csere) vagy negatív töltésű (kation - csere) gyantahoz. Például, ha a DNS -polimeráz nettó negatív töltéssel rendelkezik egy adott pH -nál, akkor anioncserélő gyanta, például dietil -amino -etil (DEAE) cellulóz használható. A nyers kivonatot az oszlopra töltik, és a DNS -polimeráz kötődik a gyantához, míg más különféle töltésű fehérjék áthaladnak. A kötött DNS -polimerázt ezután eluálhatjuk a puffer só koncentrációjának növelésével. Ez a módszer hatékony a sok szennyező anyag eltávolításában, és a mintában jelentősen gazdagíthatja a DNS -polimerázt.
Affinitási kromatográfia
Az affinitáskromatográfia egy nagyon specifikus tisztítási módszer. Kihasználja a DNS -polimeráz és a gyantára immobilizált ligandum közötti specifikus kölcsönhatást. Az egyik általános megközelítés a HIS -címke rendszer használata. Ha a DNS -polimerázt genetikailag úgy tervezték, hogy hisztidin -címkét (HIS -TAG) tartalmazzon, akkor nikkel -nitrilotriákássav (NI - NTA) gyanta használható. A HIS -címke kifejezetten a gyantán lévő nikkel -ionokhoz kötődik, lehetővé téve a DNS polimeráz szelektív megőrzését az oszlopon. Más fehérjék, amelyek nem rendelkeznek a HIS -címkével, áthaladnak az oszlopon. A kötött DNS -polimeráz eluálható az imidazol hozzáadásával a pufferhez, amely a HIS -címkével versenyez a nikkel -ionokhoz való kötéshez.
A felhasználható affinitáskromatográfia másik típusa a DNS -affinitáskromatográfia. Mivel a DNS -polimeráz természetes affinitással rendelkezik a DNS -hez, a gyanta DNS -t használható. A DNS -polimeráz kötődik a gyanta DNS -hez, és más nem -DNS -kötő fehérjéket eltávolítunk. A kötött DNS -polimerázt ezután eluálhatjuk a puffer körülmények megváltoztatásával, például a só koncentrációjának növelésével vagy a versenytárs DNS hozzáadásával.
Méret - Kizárási kromatográfia
Méret - kizárási kromatográfia, más néven gél - szűrési kromatográfia, méretük alapján elválasztja a fehérjéket. Az oszlopot porózus gyöngyök töltik meg. A kisebb fehérjék beléphetnek a gyöngyök pórusaiba, és hosszabb utakkal rendelkezhetnek az oszlopon, míg a nagyobb fehérjék áthaladnak a gyöngyök és az eluute közötti tereken. Ez a módszer hasznos a fennmaradó aggregátumok vagy kicsi - molekuláris - súlyú szennyező anyagok eltávolításához. Használható a tisztított DNS polimeráz molekulatömegének meghatározására is.
Végső tisztítás és minőség -ellenőrzés
A kromatográfiás lépések után a DNS polimeráz általában erősen tisztított. Lehet, hogy még mindig vannak kisebb szennyeződések. Végleges polírozási lépést, például hidrofób interakcióskromatográfiát vagy fordított fáziskromatográfiát lehet elvégezni az enzim további tisztítására.
Miután a tisztítás befejeződött, a szigorú minőség -ellenőrzési intézkedések nélkülözhetetlenek. A DNS -polimeráz tisztaságát olyan technikákkal lehet megvizsgálni, mint például a nátrium -dodecil -szulfát - poliakrilamid gélelektroforézis (SDS - Page). A gélen lévő egyetlen sáv magas tisztasági mintát jelez. A DNS -polimeráz aktivitását in vitro DNS -szintézis vizsgálat segítségével lehet mérni. A specifikus aktivitás, amely az enzimaktivitás mennyisége a fehérje egységenként, fontos paraméter a tisztított DNS -polimeráz minőségének értékeléséhez.
Egyéb kapcsolódó enzimek és termékportfóliónk
A DNS -polimeráz mellett cégünk számos más, magas színvonalú enzimet is kínál laboratóriumi kutatáshoz. Például megvan aGp41 protein 2.0, amely fontos szerepet játszik a DNS replikációs folyamatokban. Egy másik termék aExonukleáz III 2.0, amely hasznos a DNS -javítási és módosítási vizsgálatokhoz. És a miSC Reca 2.0részt vesz a homológ rekombinációs és a DNS -javítási mechanizmusokban.
Következtetés
A DNS -polimeráz laboratóriumban történő tisztítása összetett, de jutalmazó folyamat. A sejtek gondos növekedése, lízis, kromatográfiás tisztítás és minőség -ellenőrzés révén képesek vagyunk rendkívül tiszta és aktív DNS -polimerázt kapni. DNS -polimeráz beszállítójaként elkötelezettek vagyunk a legmagasabb minőségű termékek biztosításáért a tudományos közösség igényeinek kielégítése érdekében. Ha érdekli a DNS -polimeráz vagy más enzimtermékek, felkérjük Önt, hogy vegye fel velünk a kapcsolatot beszerzés és további megbeszélések céljából. Mindig készen állunk arra, hogy szakmai tanácsokat és támogatást nyújtsunk annak biztosítása érdekében, hogy a legjobban megfeleljen a reagenseknek a kutatási projektjeihez.
Referenciák
- Sambrook, J. és Russell, DW (2001). Molekuláris klónozás: laboratóriumi kézikönyv. Cold Spring Harbor Laboratory Press.
- Scopes, RK (1994). Fehérje tisztítása: alapelvek és gyakorlat. Springer - Verlag.
- Deutscher, MP (1990). Útmutató a fehérje tisztításához. Academic Press.