《A Micropterus Salmoides Rhabdovirus detektálási módszer létrehozása CRISPR CAS13A System Express alapján
Zhang Minlin, Huang Fengqi, Zuo Xiaoling, Liang Jiantao, Liang Kaishan, Dan Jinhong, Li Zongyang, Yu Jie, Luo Liyuan, Xie Zijie, Zhao HuiHong, Wang Qing létrehozásának felismerése. Kínai Journal of Hydrobiology, 2024, 48 (2): 283-291. Doi: 10.7541/2023.2023.0199
A Micropterus Salmoides, más néven kaliforniai basszus vagy amerikai fekete basszus, Észak -Amerikában őshonos édesvízi halak. Az utóbbi években a magas piaci igény miatt világszerte fontos tenyésztett halakká vált: a Micropterus Salmoides szilárd hús, kevés csont, finom íz, gazdag táplálkozás, különösen magas fehérjetartalmú és alacsony zsírtartalmú, amely kielégíti a fogyasztók egészséges ételek iránti igényét. Ezért a piaci ár viszonylag magas, és gyakran használják a csúcskategóriás vendéglátó piacon. Gyors növekedés: A Micropterus szalmoidák gyorsan növekszenek, és általában elérhetik az áruk specifikációit 6-8 hónapokban. Ez alkalmas rövidciklusú tenyésztésre, és gyorsan felismerheti a befektetési megtérülést. Erős betegség-rezisztencia: Más tenyésztett halakhoz képest a Micropterus Salmoides erős alkalmazkodóképességgel rendelkezik a környezethez, kevésbé nagyméretű betegség-kitörésekkel és csökkenti a tenyésztési kockázatokat. Ökológiai tenyésztés: A nagyméretű basszus összekeverhető más édesvízi halakkal, például ezüst pontyokkal és a fű pontyokkal, amelyek elősegítik a tó ökológiai egyensúlyának elérését és maximalizálhatók az erőforrások felhasználását, tovább javíthatják a tenyésztési hatékonyságot és más tényezőket. Az étkezők és az akvakultúra -gazdálkodók üdvözlik, és tenyésztési skálája az utóbbi években gyorsan növekedett.
Noha a Micropterus szalmoidák viszonylag betegség-ellenállóak, még mindig szenvedhetnek bizonyos betegségekben rossz tenyésztési körülmények között. Közülük a Micropterus Salmoides Rhabdovirus (MSRV) rendkívül káros: először 1991 -ben fedezték fel Floridában, az USA -ban. A vírust eredetileg a vadon élő nagy basszuspopulációkban detektálták, majd fokozatosan elterjedtek az Egyesült Államok sok édesvízi tavába és tározójába, és a Largemouth Bass egyik fő patogénjévé váltak.
A beteg halak klinikai tünetei
V: Egészséges nagyméretű basszus, a nyíl jelzi a tojássárgáját; B: Beteg nagymuth basszus, a nyíl jelzi a tojássárgáját.
Az átviteli forrás gyakran fertőzött sült vagy felnőtt halak, szennyezett víztestek és a vírust hordozó vadon élő halak; Ez a vírus közvetlen érintkezés, széklet kiválasztása és víztestek révén továbbítható, és valószínűbb, hogy rossz vízminőség vagy nagy sűrűségű tenyésztési körülmények között fordul elő. diffúzió. A vírus letargiát, vándorolást, hasi duzzanatot és test torzulást okozhat a fiatalkori halakban, valamint nekrotikus fekélyeket és több szerves vérzést okozhat. A fertőzés után a halálozási arány meghaladja a 90%-ot.
A mesterségesen fertőzött mikropterus szalmoidák klinikai tünetei
V: Egészséges Largemouth basszus; B, C, D: Mesterséges fertőzött nagymuth basszus.
Évente az MSRV miatt a Micropterus Salmoides Fry több mint 30% -a elveszik. Jelenleg a vírus kezelési és kimutatási módszerei továbbra is éretlenek, és nincs specifikus gyógyszer annak kezelésére. Ezért nagyon szükséges a vírust időben kimutatni a fertőzés előtt, és hatékony megelőző intézkedéseket kell tenni, amelyek bizonyos mértékben csökkenthetik a tenyésztési folyamat veszteségeit;
Ezenkívül nehéz a helyszíni észlelést elvégezni a meglévő észlelési technológiával végzett komplex detektáló berendezések nélkül. Ennek a kihívásnak a szem előtt tartásával a Dél-Kínai Mezőgazdasági Egyetem kutatócsoportja új kimutatási módszert dolgozott ki, amely a Mira-t kombinálja a CRISPR-rendszerrel. Ennek a módszernek erős specifitása, nagy érzékenysége és egyszerű működése van, ami nagymértékben javítja az MSRV detektálási hatékonyságát, és elősegíti az MSRV -t a lehető legkorábban, valamint a megelőzési és ellenőrzési intézkedések megtételét.
Mira alapozó kombinációs szűrés
Két pár különböző Mira primer használtunk a célszekvenciát tartalmazó génfragmentum amplifikálására, és az amplifikált termékeket agaróz gélelektroforézisnek vetettük alá. Az elektroforézis gráf 100 bp helyzetben volt, és mindhárom sávban fényes sávok jelentek meg, jelezve, hogy nem-specifikus amplifikációs termékek voltak. A 2. és 3. sávban 250 bp sebességű amplifikált célsávokat kvantitatív módon elemeztük az Image J szoftverrel, és a kvantitatív elemzés eredményeit "szürke érték" fejezték ki. Az elemzési eredmények alapján arra lehet következtetni, hogy minél alacsonyabb a szürke érték, annál magasabb a primer felhasználási sebessége, azaz annál magasabb a primer -specifikus kötési erősítési hatékonyság.
Az eredmények azt mutatták, hogy a specifikus kötési amplifikációs hatékonyság magas volt a MiRA-F2/R2 primer pár használatakor.
Mira primer pár szűrőel elektroforézis gélkép és szürke érték -elemzés
a. Elektroforézis Lane M: 2000 BP DNS marker; Elektroforézis 1. sáv. Negatív DNS -minta amplifikáció; Az elektroforézis-sáv 2. sáv. Mira-F1/R1 primerpár a célfragmentumot erősíti (224 bp a dobozban látható módon); Elektroforézis-sáv 3.. Mira-F2/R2 primer pár a célfragmenst erősíti (255 bp, a dobozban látható módon); b. Sávszürke érték -elemzés (a dobozban látható módon)
CRISPR/CAS13A detektáló rendszer
Miután a CRISPR/CAS13A detektálási rendszer reakciója befejeződött, az ultraibolya fényben besugárzik az eredmények megfigyelése érdekében.
CRISPR/CAS13A detektálási rendszer-fluoreszcencia fényerődiagram
1-3. Az egész rendszer RNS -standard hozzáadott; 4. Nem adtak hozzá crrNS -t; 5. Nincs hozzáadva Cas13a fehérje; 6. Nincs hozzáadva SSRNS riporter szonda; 7. negatív kontroll
CRISPR/CAS13A-MSRV optimális reakciórendszer
Kísérleteket végeztünk RNS -standardok és amplifikált minta RNS felhasználásával. A cél RNS pozicionálási sebessége jobb volt a CRRRNS2 -nél, mint a CRRRNS1 -nél. A CRRRNS1 -nek erősebb végső fluoreszcencia -jele volt, mint a CRRRN2. A 1+ crRRN2 crrRNS vegyes felhasználása egyenlő arányban kombinálhatja mindkettő előnyeit, és jobb reakcióhatékonyságot érhet el.
A CRISPR/CAS13A-MSRV detektálási reakciófeltételek és a detektálási eredmények optimalizálása
a. A standard RNS detektálási eredményeinek összehasonlítása CRRNS -t használva a különböző spacer szekvenciákkal;
b. A detektálási rendszer által eltérő hőmérsékleten észlelt standard RNS fluoreszcencia jel adatainak összehasonlítása;
c. A standard RNS fluoreszcencia -jel adatainak összehasonlítása, amelyeket a különböző koncentrációjú RNS riporter szondákkal detektáltak;
d. A detektálási eredmények összehasonlítása a detektált standard RNS detektált eredmények detektálása Cas13A/CrRNS szonda komplexek alkalmazásával, eltérő koncentrációs arányokkal;
A reakcióhőmérsékletnek a detektálási rendszerre gyakorolt hatásainak feltárása érdekében különböző reakcióhőmérsékleteket állítottunk be 31 fokos, 34 fok, 37 fok és 41 fok. A CRISPR/CAS13A-MSRV detektálási rendszer optimális reakcióhőmérséklete 37 fok volt.
Az SSRNS riporter szonda koncentrációjának a detektálási rendszerre gyakorolt hatásának feltárása érdekében a vizsgálati tartományon belül a fluoreszcencia intenzitása pozitív korrelációban volt az SSRNS riporter szonda koncentrációjával. Az SSRNS riporter szonda koncentrációjának detektálási hatása nem különbözött a 500-700 nmol/l esetén. Figyelembe véve a tényleges gazdasági problémákat, az optimális SSRNS riporter szonda koncentrációja 500 nmol/L volt.
A különféle Cas13a és CrRNS reakciókoncentráció arányának a detektálási rendszerre gyakorolt hatásainak feltárására, amikor a Cas13a: CRRNS aránya 4: 1 és 3: 1 volt, az adag/L arányonkénti arány alapján, a Cas13a elérte a telítettséget; Amikor a Cas13a mennyisége állandó volt, a fluoreszcencia jel intenzitása nem volt pozitív korrelációban a crrNS mennyiségének növekedésével. Ezért, ha a Cas13a és a CRRNS aránya 2: 1, akkor a CRISPR/CAS13A-MSRV detektálási rendszer elérheti a maximális detektálási aktivitást.
Érzékenységi értékelés
Annak érdekében, hogy feltárjuk az MSRV minimális detektálási koncentrációját a CRISPR/CAS13A-MSRV detektálási rendszerrel, az RNS-standardot egy sorozatban tízszer hígítottuk, és a CRISPR/CAS13A-MSRV detektálási rendszerrel detektáltuk. A CRISPR/CAS13A-MSRV detektáló rendszer legalább 100 fm MSRV cél RNS-t képes kimutatni. Ha a cél RNS koncentrációja alacsonyabb, mint 100 fm, a gép által észlelt fluoreszcencia jel nem különbözik szignifikánsan az üres kontrolltól. Ezért a CRISPR/CAS13A-MSRV detektálási rendszer képes kimutatni legalább 100 fm MSRV SSRNS-t.
A CRISPR/CAS13A-MSRV detektálási rendszer specifitásának értékelése az MSRV számára
Mintavizsgálat
A tengeri basszusfarmokból összegyűjtött betegségek nyilvánvaló jeleivel rendelkező beteg halminták esetében igazoltuk, hogy a beteg halak által fertőzött kórokozó MSRV volt -e. A PCR amplifikációhoz az MSRV kapszid fehérje szekvenciájára specifikus primereket használtuk, és a megfelelő sávokat elküldtük az elektroforézis diagramjában a teszteléshez. Az összehasonlítás után megerősítettük, hogy MSRV.
Az MSRV szekvenciainformációk megerősítése
a. Az MSRV primerek 228 BP terméksáv PCR -amplifikációja; b. Az MSRV kapszidfehérje szekvenciája az NCBI-hez képest a vastag szekvenciák upstream és downstream primer kötőhelyek, az árnyékolt területek pedig a CRISPR/CAS13A-MSRV CRRN1 kötés célpontjai.
Az MSRV -vel fertőzött beteg halmintákat előkezeltük és előerősítettük a vírus RNS -hez, majd a negatív kontrollcsoporttal teszteltük. Ugyanakkor a minták cDNS -jét extraháltuk a hagyományos QPCR -rel összehasonlítva. A CRISPR/CAS13A-MSRV detektálási rendszer által kimutatott pozitív minták (3., 6., 7., 8., 9., 12., 13. és 15. számú) megegyeztek a hagyományos QPCR eredményeivel, ahol a QPCR CQ értéke 18 és 25 között volt; Míg a negatív minták küszöb ciklusának száma (1., 2., 4., 5., 9., 10. és 11. számú) nagyobb volt, mint 38, jelezve, hogy a minták nem hordoztak MSVR vírust. Összefoglalva: a CRISPR/CAS13A-MSRV detektálási rendszer és a hagyományos RT-QPCR detektálási adatainak következetes volt, jelezve, hogy a CRISPR/CAS13A-MSRV detektálási rendszer megvalósítható, és bizonyos mértékig helyettesítheti az eredeti hagyományos és bonyolult detektálási módszereket.
A minta qPCR detektálási adatok vertikális összehasonlító diagramja qPCR és CRISPR
a. Az MSRV klinikai minta küszöbérték -ciklusszám -diagramjának QPCR kimutatása; A detektált mintaciklus számát összehasonlítottuk a negatív referenciakikum-számmal a T-Tests analízissel (** P<0.01);
b. CAS13A az MSRV klinikai minta fluoreszcencia diagramjának MiRA kimutatásával kombinálva; A detektált minta fluoreszcencia értékét összehasonlítottuk a negatív referencia-fluoreszcencia értékkel a T-tesztek elemzésével (** p<0.01)
Összefoglalva: a CRISPR/CAS13A-MSRV detektálási módszer nem igényel drága kísérleti műszereket, így a helyszíni észlelés gyors, pontos és kényelmes. Ezért, ha ezt a detektálási módszert az MSRV időben történő felfedezésére használják a tényleges tenyésztési folyamatban, és megcélzott és hatékony intézkedéseket hoznak, akkor ez jelentősen csökkentheti a tenyésztési folyamatban bekövetkező betegségek által okozott veszteségeket. Ezenkívül ez az észlelési módszer gyors, nagyon érzékeny és specifikus, és nagyszerű alkalmazás- és promóciós kilátásokkal rendelkezik.