A Cas12 aktivitás hangolható szabályozása elősegíti az univerzális és gyors egyedényes nukleinsav kimutatást
Kiadja: University of Science and Technology of China
Folyóirat: Nature Communications
Impact Factor: 14,7
A MIRA technológia segítségével kifejlesztettek egy univerzális, nátrium-heparinon alapuló, fluoreszcens nukleinsav kimutatási módszert (SURVEY). Tanulmányok kimutatták, hogy a nátrium-heparin szabályozhatja a Cas12a hasítási aktivitását azáltal, hogy megzavarja a Cas12a-crRNS-kötési folyamatot. A nátrium-heparin koncentrációjának beállításával a SURVEY kompatibilis mind a klasszikus, mind a szuboptimális PAM szekvenciákkal, és több Cas12 altípusra is alkalmazható. Ez a mindössze 15-20 perces észlelési idővel rendelkező módszer 95%-ot meghaladó érzékenységet és specificitást ér el a majomhimlő pszeudovírus, az influenza A vírus és a SARS-CoV-2 kimutatására. Alacsony-költségű, és új, gondozási ponton alapuló kimutatási módszert biztosít az orvosi terepi diagnosztikához és a környezeti monitorozáshoz, megoldva az érzékenység és a specifitás közötti nehéz egyensúlyt a hagyományos CRISPR diagnosztikában.
1. A heparin-nátrium hatásmechanizmusának vizsgálata
Fluoreszcens próbát adtunk a 10 nM cél DNS-t tartalmazó Cas12a-crRNS rendszerhez, és nátrium-heparin hozzáadása nélkül gyors és jelentős fluoreszcens jelet figyeltünk meg. Amikor 0,2 ug/ml nátrium-heparint adtunk hozzá, a fluoreszcens jel hasonló volt a kontrollcsoportéhoz, ami azt jelzi, hogy a nátrium-heparin nagymértékben gátolta a Cas12a. 0.2 ug/ml nátrium-heparin hasítási aktivitását a minimális gátló koncentráció. Ahogy a nátrium-heparin koncentrációja 0,2 ug/ml-ről 0,5 ug/ml-re emelkedik, a Cas12a cisz-hasítási aktivitása fokozatosan, 0,5 ug/ml-nél pedig a transz- hasítási aktivitása szinte teljesen gátolt. A nátrium-heparin hatásmechanizmusával kapcsolatos vizsgálatok kimutatták, hogy a nátrium-heparin negatív töltésű csoportjai megzavarják a crRNS Cas12a-hoz való megfelelő kötődését, és befolyásolhatják a crRNACas12a bináris komplex kialakulását.
- MIRA-Cas12a one-pot észlelés
A nátrium-heparin hatásmechanizmusának validálása után a tanulmány egy egyedényes kimutatási stratégiát (MIRA-Cas12a) vizsgált meg, amely a MIRA-amplifikációt és a Cas12a-közvetített fluoreszcenciadetektálást egyetlen csőben kombinálta.
Nátrium-heparin hiányában a MIRA-Cas12a kombináció nem produkált szignifikáns fluoreszcens jelet a 0,1-10 fM célgénkoncentráció-tartományban. 40 µg/ml nátrium-heparinnál szignifikáns fluoreszcencia jelet figyeltek meg az 1 aM (≈0,6 kópia/μL, térfogat=30 μL) és 10 fM közötti (≈6000 kópia/μL, térfogat=30 μ10-szereshez képest) 0 µl feletti koncentráció-tartományban. nátrium-heparin nélküli rendszer.
A majomhimlő vírus templát koncentrációja 10 fM volt, és Cas12a-crRNS-t (100 nM) használtunk az f31 és b6r célgének kimutatására. Az amplifikációs reakciót 0, 2, 4, 6, 8, 12, 16 és 20 percnél fejeztük be, és a MIRA amplifikációs termék tartalmát különböző időpontokban agarózgélen elemeztük. A kapott termékeket ezután agaróz gélen elemeztük három különböző beállítás mellett: MIRA-heparin-nátrium Cas12a nélkül, MIRA-Cas12a heparin-nátrium nélkül és MIRA-Cas12a heparin-nátriummal. Az eredmények azt mutatták, hogy heparin-nátrium hiányában a nukleinsav-amplifikáció gátolt a Cas12a magas cisz-hasítási aktivitása miatt. A heparin-nátrium hozzáadása azonban jelentősen megnövelte a nukleinsav-amplifikációt a Cas12a cisz-hasítási aktivitásának csökkenése miatt.
A cikk bemutatja, hogy a nátrium-heparinon alapuló univerzális egy-pot fluoreszcens nukleinsav kimutatási módszer (SURVEY) megvalósítható mind a klasszikus PAM, mind a szuboptimális PAM szekvenciák használatával. Ezenkívül az LbCas12a mellett az AsCas12a és az AapCas12b is széles körben használatos a CRISPR-Dx módszerekben. A MIRA-AsCas12a-t használó rendszerben a fluoreszcenciát csak 40 ug/ml nátrium-heparin jelenlétében figyelték meg, ami azt jelzi, hogy 1fM f31 és b6r gént képes kimutatni. Nátrium-heparin hiányában a MIRA-AapCas12b 1 f31 és b6r gént képes kimutatni. 20 ug/ml nátrium-heparin beadása nemcsak a MIRA-AapCas12b kimutatási sebességét gyorsította fel, hanem a fluoreszcencia intenzitását is. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a nátrium-heparin adagolásával kifejlesztett egyedényes módszer más Cas12 altípusokra is alkalmazható.
