《Új cas13a/cas12a-mediált újdonság fejlesztése"Egygár" kettős Detektálási vizsgálat a géntechnológiával módosított növények expresszálására
A genetikailag módosított növényeket széles körben ültették a világ minden tájáról, és sok ország fokozatosan javította szabályozási intézkedéseiket a géntechnológiával módosított növények biztonságának biztosítása érdekében. A gyors és pontos helyszíni genetikai detektálási módszerek kidolgozása nagyon fontos a mezőgazdaság és a biológiai biztonság szempontjából, és enyhítheti a géntechnológiával módosított termékekkel kapcsolatos nyilvánosság aggodalmait.
Ebben a tanulmányban a kutatócsoport új egy-pot-reakciót fejlesztett ki a -- Mira kettős detektálással, a kettős CRISPR-vel (MR-DCA módszerrel) kombinálva a CAMV35S és a NOS genetikai célok egyidejű kimutatására genetikailag módosított növényekben, egyszerű és hatékony detektálási módszert biztosítva a genetikailag módosított terek kimutatására.
Kísérleti módszerek
A Mira kettős terméket a CAS13A és a CAS12A kettős rendszer elemzi, hogy két független jelet generáljon, amelyek nem zavarják egymást, majd a fluoreszcens színt egy megvilágító eszköz vagy egy két T-vonalú tesztcsík olvassa el a kettős csatornás leolvasás elérése érdekében. A teljes folyamat kevesebb, mint 35 perc alatt fejeződik be, a detektálási határérték akár 20 példányban is.
(A CAMV35 és NOS MR-DCA kimutatásának alapelve)
A teljes kísérlet három lépésre oszlik: a Mira amplifikáció, a CRISPR reakció és az eredmény értelmezésének két módszere.
A CAMV35S gént használják a CAS13A célpontjaként, és a NOS gént a CAS12A célpontjaként használják. Két pár Mira primert terveztek. A Cas13a rendszer csak az RNS -t ismeri fel, tehát az előremenő primer régiót tervezték, amely T7 promótert tartalmaz a Cas13a későbbi transzkripciójára és aktiválására. Pamot adunk a NOS génhez. A fenti kiegészítések biztosítják, hogy mind a Cas13a, mind a Cas12a fehérjék kötődjenek a megfelelő CRRNS-ekhez, és a két rendszer között nincs interferencia vagy keresztreakció.
Kísérleti helyzet
Érzékenység és specifitás
A mintát gradiensben hígítottuk, hogy megvizsgáljuk a Mira -reakció fluoreszcencia intenzitását. Megállapítottuk, hogy a fluoreszcencia intenzitása továbbra is kimutatható 20 μl mintakoncentrációban. Végül kiválasztottuk a 20 μl koncentrációját a kísérlethez.
(Különböző mintakoncentrációkat és tesztcsíkokat használnak a színfejlesztéshez és az intenzitás kvantitatív számításához)
Az MR-DCA specifitásának további értékelése érdekében a kutatócsoport nem transzgenikus állatok és nem transzgenikus növények vegyes mintáit vizsgálta. Az eredmények azt mutatták, hogy csak a CAMV35 -et és NOS -t tartalmazó transzgenikus minták voltak magas fluoreszcencia jelekkel, míg más minták fluoreszcencia intenzitása közel volt a negatív kontrollhoz. Az MR-DCA használható specifikus kettős célú nukleinsav-detektáló platformként.
24 növénymintát MR-DCA tesztelt. Közülük az 1, 2, 15, 16, 21 és 22 a transzgénikus kukorica, amely CAMV35S promotert tartalmaz. A 7., 8., 23. és 24. a betegségálló transzgenikus rizs, amely NOS-terminátort tartalmaz. A 3, 4, 11, 12, 13, 14, 17 és 18, a CAMV35S promótert és a NOS -terminátort tartalmazó transzgenikus szójabab.
(24 minta teszteredményei)
Gyors reakció
A reakcióidő fontos tényező a helyszíni kimutatásban. A kutatócsoport megfigyelte, hogy a FAM és a HEX fluoreszcencia jeleit fluoreszcencia eszközzel lehet kimutatni, amikor a reakcióidő 10 perc volt. A Mira és a CRISPR reakció kombinációja 15 perc elteltével is megfigyelt sárga fluoreszcenciát.
(Fluoreszcencia jel különböző Mira reakcióidőkben)
(A tesztcsíkok színfejlesztése különböző Mira reakcióidőkben és az intenzitás kvantitatív számításában)
Kísérleti következtetés
A kísérleti eredmények azt mutatták, hogy a kettős Mira jó specifitással rendelkezik, és pontosan megszerezheti a CAMV35 és NOS amplifikációs termékeit. A CAS13A és a CAS12A rendszerek önállóan reagálnak, anélkül, hogy zavarnák egymást. Az MR-DCA-teszt pontosan 20 példányt képes észlelni alacsony hőmérsékleten, 35 perc alatt, ami nagy jelentőséggel bír a genetikailag módosított növények detektálásában a terepen.
Cikkinformációk
Journal neve: 《Journal of Advanced Research Express
Cikk címe: 《Egy új CAS13A/CAS12A-mediált "egy-pot" kettős detektálási vizsgálat fejlesztése géntechnológiával módosított növények expresszálása
Impact faktor: 11.4
Kutatócsoport: Wang Xiaofu, Zhejiang Mezőgazdasági Tudományos Akadémia