A füves garnélarák fontos gazdasági faj a kínai édesvízi akvakultúra -iparban. Az utóbbi években azonban aHepatopancreatic mikrosporidium(EHP), a garnélarák hepatopancreasát megfertőző parazita súlyosan befolyásolta az iparágot. Mivel jelenleg nincs hatékony gyógyszer vagy oltás ennek a betegségnek a kezelésére, a gyors és pontos kimutatás elengedhetetlen annak elterjedésének megakadályozásához.
A.Magnifikált 9. 0 × 1 0 3 -szor; B. Nagyított 5,0 × 104 -szer.
Qiao Yi, Shen Hui, Wan Xihe, rajongó Xianping, Jiang Ge, Li Hui, Wang Libao, Shi Wenjun, Cheng Jie. A hepatopancreatic mikrosporidium izolálása és morfológiai megfigyelése a litopenaeus vannamei -ben. Journal of Fishery Sciences of China, 2018, 25 (5): 1051-1058. Doi: 10.3724/sp.j.1118.2018.17430.
Az EHP kimutatása elsősorban a molekuláris biológiai módszerekre támaszkodik, a PCR technológia a leggyakoribb. Noha a PCR nagy érzékenységet kínál, drága PCR -berendezéseket és speciális laboratóriumi környezetet igényel, így nem alkalmas terepi használatra. Ennek a kérdésnek a kezelése érdekében a kutatócsoport két gyors észlelési módszert fejlesztett ki a Mira technológián alapuló. Ezek a módszerek nagy érzékenységet, gyors választ és egyszerű működést kínálnak, lehetővé téve az EHP hatékony és gyors észlelését a garnélarákban a helyszínen, anélkül, hogy összetett laboratóriumi berendezésekre lenne szükség, ezáltal kitöltve a jelenlegi észlelési módszerek rést.
A vizsgálatban alkalmazott erősítő reagensek:
- DNS -izotermikus gyors amplifikációs készlet (BASIC)
- DNS -izotermikus gyors amplifikációs készlet (kolloid aranyszalag típusa)
A Mira technológia egy multi-enzim izotermikus gyors nukleinsav-amplifikációs módszer. Alapvető alapelve magában foglalja a több funkcionális fehérjék koordinált hatását környezeti hőmérsékleten a gyors nukleinsav-amplifikáció elérése érdekében, lehetővé téve a valóban hordozható, helyszíni nukleinsav kimutatását.
Kutatási módszerek
Minta kivonás
A kutatócsoport mind a fertőzött, mind az egészséges fű garnélarák mintáit összegyűjtötte a Liaoning tartomány három garnélarák -gazdaságából, kivonva a DNS -t a garnélarák hepatopancreasából.
Alapozó kialakítás
Három Mira -primer halmazt terveztek az EHP S8 szerinfehérje génjének (GenBank csatlakozási száma: 182063) céljából. Ennek a génnek egyedi aktív helye van, biztosítva a detektálás specifitását.
Mira-kor és mira-lfd detektálás
A) Optimalizált RPA-Age reakcióhőmérséklet. M: DL 500 jelölő; N: negatív kontroll; Törzsek 1-5: 25 fok, 30 fok, 37 fok, 39 fok és 42 fok.
(B) Optimalizált RPA-Age reakcióidők. M: DL 500 jelölő; N: negatív kontroll; 1: 10 perc; 2: 20 perc; 3: 30 perc; 4: 40 perc.
C) Optimalizált RPA-LFD reakcióhőmérsékletek. N: negatív kontroll; 1: 25 fok; 2: 30 fok; 3: 37 fok; 4: 39 fok; 5: 42 fok.
(D) Optimalizált RPA-LFD reakcióidők. N: negatív kontroll; 1: 5 perc; 2: 10 perc; 3: 20 perc.
Az EHP kimutatására a két Mira-detektálási módszert, a Mira-kor (agaróz gélelektroforézis) és a MiRA-LFD (kolloid arany laterális áramlás immunoassay). A kutatócsoport kísérletezés útján optimalizálta a reakció hőmérsékletét és időpontját. A Mira-korszak 30 perc alatt felerősítette a cél DNS-t 37 fokos, míg a Mira-LFD mindössze 10 perc alatt végzett 37 fokos amplifikációt, az eredményeket 5 percen belül olvasható.
Kísérleti eredmények
Specifitás és érzékenység
(A) Az RPA-Age detektálásának specifitása. M: DL 1000 jelölő; P: Nosema bombycis; 1: EHP; 2: encephalitozoon; 3: Microsporidia; 4: Fehér folt szindróma vírus; 6: rendellenes; N: Negatív kontroll.
B) Az RPA-LFD detektálásának specifitása. P: Nosema bombycis; N: negatív kontroll; 1: EHP; 2: encephalitozoon; 3: Microsporidia; 4: Fehér folt szindróma vírus; 6: Rendellenes.
(C) Az RPA-kor érzékenysége a rekombináns plazmidok gradiens hígításával. M: DL 500 jelölő; N: negatív kontroll; 1: 4,7 × 10^5 példány/µl; 2: 4,7 × 10^4 példány/µl; 3: 4,7 × 10^3 példány/µl; 4: 4,7 × 10^2 példány/µl; 5: 4,7 másolat/µl; 6: 4,7 másolatok/µl.
(D) Az RPA-LFD érzékenysége a rekombináns plazmidok gradiens hígításával. N: negatív kontroll; 1: 4,7 × 10^5 példány/µl; 2: 4,7 × 10^4 példány/µl; 3: 4,7 × 10^3 példány/µl; 4: 4,7 × 10^2 példány/µl; 5: 4,7 másolat/µl; és 6: 4,7 példány/µl.
A kísérletek kimutatták, hogy a MiRA technológiának nagy a specifitása, pontosan kimutatja az EHP -t anélkül, hogy más kórokozókra reagálna. Az érzékenység szempontjából mindkét módszer detektálási határértéke 4,7 példány/µl volt, ami szignifikánsan magasabb, mint a hagyományos PCR érzékenysége.
Klinikai mintavizsgálat
A 30 klinikai minta tesztelésének eredményei azt mutatták, hogy a Mira-kor és a Mira-LFD pozitivitási aránya 70%, valamivel alacsonyabb, mint a QPCR 80%-a, de szignifikánsan magasabb, mint a hagyományos PCR 56,7%-a.
Alkalmazási kilátások
A Mira-alapú detektálási módszerek lehetővé teszik a célgének gyors amplifikálását állandó hőmérsékleten. Különösen a MiRA-LFD módszer mindössze 10 perc alatt képes eredményeket hozni komplex laboratóriumi berendezések nélkül, így ideális a garnélarák gazdaságok helyszíni használatához. Ennek a technológiának a nagy érzékenysége és sajátossága hatékony eszközévé teszi az EHP korai felismerését és ellenőrzését, ezáltal védve a fű garnélarák -gazdálkodási iparának egészségét és fejlődését.
Ezen módszerek közül a kolloid arany laterális áramlási immunoassay (Mira-LFD) különösen jól alkalmazható a helyszíni alkalmazásokhoz egyszerűség és intuitív eredmények miatt. A fű garnélarák -gazdálkodók gyorsan felismerhetik és reagálhatnak az EHP -fertőzésekre, javíthatják a betegség -ellenőrzési képességeket, jelentősen növelik a gazdálkodás hatékonyságát és csökkentik a gazdasági veszteségeket.