A macskafélék chaphamaparvovírusának látható és gyors kimutatása multienzimes izotermikus gyors amplifikáció és laterális áramlási mérőpálca-teszt segítségével
Folyóirat:Frontiers in Cellular and Infection Microbiology
Impact Factor:4.6
Macska chaphamaparvovírus(FeChPV)egy új parvovírus, amelyet először 2019-ben mutattak ki hasmenéses macskákban Kanadában. Patogenitása és molekuláris jellemzői továbbra is tisztázatlanok, gazdaszervezeti és genetikai sokféleséget mutat, ami további epidemiológiai vizsgálatot igényel. Jelenleg nincs szabványos módszer a FeChPV kimutatására.
A multienzimes izoterm gyors amplifikációs -lateral flow mérőpálca (MIRA-LFD) módszersikeresen alkalmazták különféle vírusok kimutatására, olyan előnyöket kínálva, mint a gyorsaság, az egyszerűség, és nincs szükség precíziós műszerekre. A kutatócsoport kidolgozott egy MIRA-LFD-módszert, amely alkalmas a FeChPV-re, hogy kezelje a helyi szintű klinikai kimutatás kihívásait. Anélkül, hogy precíziós műszerekre hagyatkozna,a MIRA{0}}LFD módszer 20 percen belül befejezte a FeChPV kimutatását 37 fokon, és nem mutatott kereszt-reaktivitást más vírusokkal. Az észlelési határ 32,3 kópia/μL volt,10-szer magasabb, mint a PCR módszer. Ezenkívül a MIRA-LFD módszer 29 FeChPV-pozitív mintát mutatott ki 417 hasmenéses macska közül, amelyek pozitivitási aránya valamivel magasabb, mint a Nested PCR módszeré. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a FeChPV kimutatására bevezetett MIRA-LFD módszer hatékony, gazdaságos, megbízható és egyszerű módszer, amely hozzájárul a FeChPV fertőzés korai megelőzéséhez és ellenőrzéséhez.
1. Kísérleti módszerek
Klinikai minták:Az ebben a vizsgálatban használt rektális tamponmintákat 632 macskától (köztük 417 hasmenéses és 115 egészséges macskától) és 474 kutyától (köztük 342 hasmenéses és 132 egészséges kutyától) vettek a Guangdong, Henan, Anhui, Zhejiang2 és az Autonomousner2 tartományok20 és Innomousner2 tartományok közötti állatorvosi klinikákon. 2024.
Nukleinsav-amplifikáció:Az extrahált DNS-nukleinsavat hozzáadtuk a MIRA rendszerhez. A rekombináz és a primerek komplexet képeztek; segédfehérjék és egy-szálkötő fehérjék segítségével behatoltak a kettős-szálú DNS-templátba. A primerek homológ komplementer régiókhoz kötődnek, és egy D-hurokrégiót alkotnak, míg a rekombináz szétesett a komplexből. A polimeráz a primerek 3' végéhez kötődött, és elindította a DNS-szintézist, exponenciálisan amplifikálva a templát célrégióját. Ez a folyamat gyorsan és hatékonyan cikázott, így mindössze 15 perc alatt elérte a célfragmens ultragyors amplifikációját.
Tesztcsík színfejlesztés:A nukleinsav-amplifikációs terméket 1:10 arányban hígítottuk, felvittük a tesztcsíkra, és az eredményeket 5 perc múlva leolvastuk.
A teljes folyamat a nukleinsav-amplifikációtól a tesztcsík színének kialakításáig mindössze 20 percig tartott.
Amp{0}}future biológiai termékeket használtunk a kísérletben:
A vizsgálat során négy tervezett specifikus primer{0}}szonda kombinációt vizsgáltak meg. Az eredmények bemutatásához agaróz gélelektroforézist és nukleinsav tesztcsíkokat is használtunk. Mind a négy primer{3}}próbakombináció képes kimutatni a FeChPV vírust. Az agaróz gél elektroforézis eredményei szerint a FeChPV-4 kombináció mutatta a legfényesebb célsávot, ezért ezt a kombinációt választottuk ki a későbbi vizsgálatokhoz.
Az agaróz gél elektroforézis eredményei szerint az 5, 10, 15 és 20 perces amplifikáció mind a célsávot eredményezte. A célsáv intenzitása 15 perces amplifikációnál érte el a csúcsot, ami 15 percet határoz meg az optimális reakcióidőnek ehhez a vizsgálathoz. A 36 fokos, 37 fokos, 38 fokos, 39 fokos és 40 fokos amplifikáció mind a célsávot eredményezte, a legfényesebb sáv pedig 39 fokon volt megfigyelhető, ami 39 fokot határoz meg az optimális reakcióhőmérsékletnek ehhez a vizsgálathoz.
(A ábra: 1: erősítés 5 perc; 2: erősítés 10 perc; 3: erősítés 15 perc; 4: erősítés 20 perc) (B ábra: 1: 36 fokos erősítés; 2: 37 fokos erősítés; 3: erősítés 38 fok; 4: 9 fokos erősítés 4
2.Érzékelési teljesítmény
Érzékenység:
(A ábra: A MIRA eredmények agaróz gélelektroforézissel bemutatva)
(B ábra: Beágyazott PCR eredmények agaróz gélelektroforézissel bemutatva)
(C ábra: A MIRA eredmények nukleinsav tesztcsíkokkal bemutatva)
A mintákat 10-szeres sorozathígításnak vetettük alá, 3,23 × 106 kópia/μL-től kezdve. Az agaróz gél elektroforézissel végzett beágyazott PCR 3,23 × 102 kópia/μL stabilan detektált; A MIRA agaróz gél elektroforézissel és a MIRA nukleinsav tesztcsíkokkal egyaránt stabilan 3,23 × 10¹ kópiát tudott kimutatni/μl.
A MIRA módszer konzisztens érzékenységet mutatott két különböző eredménymegjelenítési formátum használatával, és a MIRA módszer érzékenysége jobb volt, mint a beágyazott PCR.
Specifikusság:
(1: FeChPV, macska chaphamaparvovírus; 2: FPV, macska panleukopenia vírus; 3: FeAstV, macska asztrovírus; 4: FBoV, macska bocavírus; 5: CachaV, kutya chaparvovírus; 6: negatív kontroll)
Az újonnan létrehozott MIRA{0}}LFD módszer csak a FeChPV-t észlelte, és nem mutatott keresztreakciót más referenciavírusokkal, ami jó specificitást jelez.
3. A tanulmány összefoglalása
Ez a tanulmány létrehozta a MIRA-LFD módszert a FeChPV kimutatására, anélkül, hogy nagy pontosságú{1}}műszerekre lenne szükség. A MIRA-LFD módszer hatékony, gazdaságos és megbízható, nagy érzékenységű és specificitású kimutatási módszerként alkalmasabb klinikai kimutatásra, technikai támogatást nyújtva a FeChPV fertőzés korai megelőzéséhez és ellenőrzéséhez.
4.AMP-JÖVŐ BIOTECHNIKA
A MIRA multienzimes izoterm, gyors nukleinsavamplifikáció olyan technológia, amely valóban lehetővé teszi a helyszíni gyors{0}}detektálást.
A MIRA technológia az in vivo génrekombinációs javító mechanizmuson alapul, amely több funkcionális fehérje szinergikus hatásán alapul szobahőmérsékleten, hogy gyors (5-20 perc), érzékeny, specifikus és biztonságos nukleinsav-amplifikációt érjen el szobahőmérsékleten (25-45 fok). A MIRA technológia izoterm jellegéből adódóan alacsony a felszerelésigénye és egyszerű a kezelése. A miniatürizált hordozható eszközök révén alkalmazható a legkülönfélébb alkalmazási forgatókönyvek élvonalbeli tesztelésére, így gyors és pontos nukleinsavtesztet tesz lehetővé olyan környezetekben, mint a POCT, otthoni tesztelés, mezőgazdasági területek és a helyszíni bűnüldözés. A MIRA technológiára alapozva az Amp-future Biotech helyszíni gyorstesztelési termékek sorozatát fejlesztette ki, beleértve a gyors nukleinsav-felszabadító szereket, izoterm, gyors nukleinsav-amplifikációs reagenseket, kolloid arany tesztcsíkokat és miniatürizált hordozható berendezéseket, átfogó megoldást hozva ezzel a helyszíni gyorstesztelésre. Ezenkívül az Amp-future MIRA technológiája alkalmazási előnyöket kínál a CRISPR technológiával, NGS-sel, SNP-vel, mikrofluidikával és még sok mással kombinálva.
A fent bemutatott, helyszíni -gyorstesztelési termékek sorozatán kívül az Amp-future Biotech a következőket is kínálja:
Kutatási reagensek:Reagens nyersanyagok és műszaki támogatás biztosítása tudományos alapkutatásokhoz, valamint projektirodalmi hivatkozások.
OEM gyártás:Képes önállóan nagy-tisztaságú, nagy-aktivitású késztermékek előállítására a teljes folyamat során, ipari-léptékű gyártást érve el.
A projekt megrendelt fejlesztése:Szekvenciainformációk és szekvencia-illesztési elemzési eredmények, projekt primer{0}}próbatervezés és szintézis, projekt plazmidszintézis és minták, projektjelentések és eredmények stb.
További információért keressen bizalommal.